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期刊：Cell Reports；影响因子：8.109
发表单位：约翰霍普金斯大学等
高级浆液性卵巢癌（HGSC）是导致大多数与卵巢癌相关的死亡的最常见和致命的卵巢癌类型，了解卵巢癌发生、发展和治疗敏感性的分子机制是进一步提高患者生存率的关键步骤。先前已有大规模的组学研究中对肿瘤组织进行了广泛的分析，包括基因组、转录组、蛋白组以及表观修饰等，然而对于蛋白质翻译修饰而言，除磷酸化外，尚未在大规模蛋白质组学研究中研究其他蛋白质修饰。糖基化在癌症发展过程中起着至关重要的作用，例如细胞间粘附、细胞生长、配体-受体结合和肿瘤转移。与其他蛋白质修饰相比，糖蛋白的分析由于糖蛋白结构的巨大复杂性和异质性而受到限制。糖蛋白组学技术的最新进展已使复杂糖蛋白的全面分析成为可能。
2020年10月发表在《Cell Reports》的一项研究中，利用蛋白质组学和N-链接糖基化蛋白质组学技术，地分析了83例HGSC患者肿瘤组织及23例健康输卵管组织标本。研究提供了HGSC完整的蛋白组学和糖蛋白组学特性，发现肿瘤中的糖蛋白在多个水平上受到调节，包括糖蛋白丰度、确定的特定糖位处糖基化的总体程度以及糖位处糖基化的类型，并揭示了以前从未研究过的蛋白质糖基化在卵巢癌中的潜在功能。
由于一系列修饰，许多基因产物表现出极大的结构异质性。这些修饰不是直接编码在基因组模板中，但往往影响蛋白质的功能。蛋白质糖基化在蛋白质正常功能中起着至关重要的作用。但是，与其他蛋白质修饰（例如磷酸化）相比，糖蛋白的分析具有挑战性。本研究对83个前瞻性收集的高级浆液性卵巢癌（HGSC）和23个非肿瘤组织进行了蛋白质组学和糖蛋白组学的综合分析，揭示了肿瘤特异性糖基化以及与三个肿瘤簇相关的不同糖基化，并鉴定了与糖基化改变相关的糖基化酶。
83个卵巢癌和23个相关非肿瘤组织的蛋白质组学和糖蛋白组学；
糖基化与3个肿瘤簇相关；
糖蛋白和糖位的肿瘤特异性变化显而易见；
确定负责糖基化改变余汪的酶。
收集了83例未经治疗的HGSC肿瘤和23例非肿瘤组织，用于定量蛋白质组学和N-连接糖蛋白组分析。总共鉴定出8144种蛋白质，其中1690个含N-连接糖基的肽。根据已鉴定的N联聚糖的单糖组成，定义了三种聚糖类型：低聚甘露糖/高甘露糖（HM），含有两个N-乙酰基己糖胺（N）和己糖（H）而没有另外的岩藻糖（F）或唾液酸（S）的聚糖；唾液酸化聚糖（Sia），代表任何含有S的聚糖；以及岩藻糖基化聚糖（Fuc），代表任何已鉴定的含有F的聚糖。
为了研究HGSC的迅毁橡癌症异质性，作者使用糖蛋白组学数据进行聚类分析，鉴定了3种糖肽簇（IGP1-3）。通过计算了IGP簇与临床表型的相关性，IGP3与肿瘤细胞数量呈负相关，与网膜的解剖部位呈负相关。功能分析显示，IGP1富含溶酶体，IGP2中富含磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt信号通路、粘着斑和细胞外基质（ECM）-受体相互作用，IGP3富含补体和凝血级联。结果还显示了与IGP簇相关的聚糖，包括IGP1中的HM聚糖，IGP2中的HM和Fuc聚糖，IGP3中的Fuc和Sia聚糖。
先前研究已报道，IGP肿瘤簇与分化、免疫反应、间充质和增生等4种亚型有关。作者进一步探索本研究中IGP肿瘤簇与肿瘤亚型的关系，发现免疫反应性亚型的特征蛋白在IGP簇1中升高，间充质的特征蛋白在IGP2中降低而在IGP3中升高，这表明IGP1与免疫反应性亚型有关，而IGP3与间充质亚型有关。通过评估基质细胞和免疫细胞对聚类结果的影响，IGP1簇似乎不受肿瘤纯度或基质评分的影响，IGP2具有相对较高的肿瘤纯度和较低的基质和免疫评分，IGP3具有较低的肿瘤纯度和较高的基质和免疫评分。
蛋白糖基化水平的主成分分析（PCA）显示，肿瘤和非肿瘤样本存在明显界限。与非肿瘤样品相比，在肿瘤中48个糖肽显著上调，而94个糖肽显著下调。为了寻找对卵巢癌诊断的可能有用的差异糖蛋白，作者使用受试者工作特性曲线评估了糖肽特征，显示HYOU1、FKBP10、PSAP和PPT1能够对肿瘤和非肿瘤组织进行良好分类。功能分析显示，溶酶体是肿瘤亩旁样品中显著上调的糖肽富集的通路，而补体和凝血级联通路、ECM-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、局灶性在肿瘤样品中被下调糖肽富集。比较肿瘤样品和非肿瘤样品之间糖肽的相对丰度，观察到带有HM型聚糖的糖肽在肿瘤中具有更高丰度，而含有Fuc和Sia的糖肽在肿瘤中丰度低。含HM、Fuc或Sia的糖肽涉及的途径表明，溶酶体途径是含HM的糖肽中最富集的途径，Euc糖肽富集ECM-受体相互作用，Sia糖肽富集凝血级联反应。
比较肿瘤和非肿瘤样品中蛋白糖基化和蛋白表达，糖基化位点和糖蛋白在肿瘤中显示出不同的调节水平，糖蛋白可能受糖基化占有率以及整体蛋白表达的调控。尽管含糖基肽的大多数差异丰度变化仍与相应的整体蛋白表达正相关，但某些糖蛋白糖基的丰度变化可能显示出与其全局水平不同的表达模式。例如，卵巢癌的生物标志物之一MCU16，在HGSC和健康输卵管中蛋白表达量相近，但其两个糖修饰位点MUC16_12272和MCU16_12586的糖基化修饰水平则在HGSC中明显升高，这表明简单地测量蛋白质丰度和随后的基于蛋白质的聚类可能不足以全面了解肿瘤生物学。与非肿瘤相比，肿瘤中糖肽的丰度变化不仅受每个糖位处的糖基化反应程度的调节，也受到修饰糖位的聚糖的影响。含HM聚糖的糖肽在肿瘤中大多过表达，而含其他类型含聚糖的糖肽的丰度变化则各不相同，并观察到在相同糖位上糖基化的异质性。
为了研究聚糖表达的调节，作者将糖肽数据集中每个肿瘤和非肿瘤样品中糖肽的丰度与从蛋白质组学数据集中确定和量化的糖基化酶的蛋白质丰度进行了关联，发现具有HM聚糖糖基化的糖肽与糖苷酶2亚基β（PRKCSH）的表达呈正相关。同时，在所有已识别的糖基化酶中只有PRKCSH被发现在肿瘤中显著上调，经HM聚糖修饰的糖肽在肿瘤样品中增加。
为了确定HM修饰对糖蛋白的潜在作用，作者分析了部分糖基化生物合成途径以合成具有关键糖基化酶功能的HM。肿瘤细胞中PRKCSH表达的增加可能导致具有HM糖基化的糖蛋白升高，从而阻止了进一步详细的复杂碳水化合物合成。HM聚糖修饰的这种增加对于为肿瘤生长大量合成的糖蛋白可能至关重要，对癌细胞中被HM修饰的糖蛋白网络的研究可能有助于鉴定快速细胞生长所需的糖蛋白。通过蛋白网络分析，作者发现肿瘤中上调的HM糖蛋白质参与了一个主要与溶酶体、胶原代谢过程和内膜有关的网络。总之，通过分析由HM聚糖修饰的糖肽，该研究确定了糖蛋白是癌症发展所需的潜在靶标。
在这项研究中，综合的多组学分析，包括HGSC的蛋白质组学和糖蛋白组学分析，证明了糖基化与卵巢癌的联系。通过应用多组学数据在肿瘤和非肿瘤之间的差异表达，鉴定了几种潜在的肿瘤特异性蛋白，糖蛋白和聚糖。进一步的研究表明，肿瘤中糖蛋白表达的差异可以表现为糖位处糖基化程度的差异以及糖位上聚糖的类型。肿瘤的糖基化生物合成途径不同于非肿瘤，由于PRKCSH的上调，N-连接的糖蛋白在肿瘤中可以携带更多的HM聚糖，这可能是PRKCSH调节肿瘤中有效糖蛋白产生、抗环境压力和溶酶体过度活化的常见机制。总之，HGSC肿瘤样品的综合蛋白质组学和糖蛋白质组学测量提供了宝贵的公共资源，将糖蛋白与其糖基化程度、聚糖修饰和糖基化酶联系起来的糖蛋白组学数据将改善未来对卵巢癌分子基础的了解。
肿瘤生物消毁学指研究肿瘤发生发展分子机制，以及肿瘤防治的生物科学：地介绍肿瘤细或改胞的衫桥判结构性改变以及由此产生的功能改变，及肿瘤的一般生物学特点，另外包括肿瘤的病因学、发病学、肿瘤的防治及相关知识等。
A Tuft Cell-Like Signature Is Highly Prevalent in Thymic Squamous Cell Carcinoma and Delineates New Molecular Subsets Among the Major Lung Cancer Histotypes
胸腺鳞状细胞癌中高度流行一种类似于Tuft细胞的特征，并在主要的肺癌组织型中划分出新的分子亚型
发表期刊：J THORAC ONCOL
发表日期：2021 Feb 17
影响因子：13.357
DOI:10.1016/j.jtho.2021.02.008
一、研究背景
胸腺上皮瘤（TETs）包括胸腺瘤和侵袭性较强的胸腺昌梁癌（TCs）。胸腺瘤根据新生上皮细胞的组织形态和未成熟T细胞的比例，可分为A型、AB型、B1型、B2型、B3型和其他罕见类型。TCs的分化程度不一，但胸腺鳞状细胞癌（TSQCCs）约占80%的病例。由于它们的罕见性和代表性细胞系的匮乏，现阶段对TETs的生物学认识不足。手术以外的治疗仍然主要是经验性的，有效的长期治疗方案蚂铅是不可用的。
二、材料与方法
1数据来源
1）TCGA：胸腺瘤（也包括TC）（N = 117，包括A型(N = 10)、AB型(N = 48)、B1型(N = 12)、B2型(N = 25)、B3型(N = 10)、微结节胸腺瘤(N = 2)和TCs(N = 10)），肺SQCC和肺腺癌。
2）GSE57892：包含22例TETs型A(N = 5)、AB(N = 2)、B2(N = 3)和B3胸腺瘤(N = 5)和TC(N = 7)
3）George等人提供的66例肺LCNECs
4）RT-qPCR：60个速冻的TETs病例
5）免疫组化的分析：该队列包括胸腺瘤、胸腺和非胸腺SQCCs以及神经内分泌肿瘤（NENs）
2分析流程
1）RT-qPCR、IHC、Western Blotting
2）统计分析：Wilcoxon检验、Student's t检验、chi-square检验、Fisher's exact检验、无监督聚类、富集分析、生存分析
3）胸腺滤泡细胞耐物运表达试剂盒：根据最近发表的小鼠胸腺上皮细胞（TEC）亚集（GSE114651）的基因表达标志，16 KIT，人TC标记的小鼠同源物KIT的mRNA表达水平在小鼠胸腺Tuft细胞中高于其他mTEC亚集和皮质TECs。这一发现促使作者调查已发表的人类胸腺瘤和TCs的基因表达数据集，以获得Tuft细胞标记物。
三、结果展示
01 -TCs在mRNA水平上表达胸腺滤泡细胞相关基因
搜索TCGA 数据集的胸腺瘤和TCs的24个基因的mRNA表达水平，这些基因在正常的小鼠胸腺Tuft细胞中特征性地表达，但不在其他正常TEC亚集，作者发现TCs经常表达这些基因。
POU2F3，Tuft细胞的主调节器，和ALOX5，GFI1B，CHAT和L1CAM的表达水平显著高于TCs比A型（CHAT除外），AB和B1-3胸腺瘤（图1）。通常局限于正常皮质TEC和非tuft细胞mTEC亚群15的基因在TC中的表达与胸腺瘤相比没有显著升高（补充图3A）。在Petrini等人提供的独立TET数据集中也观察到TC中Tuft细胞标志物的上调（补充图3B）。最后，在60个速冻TET队列中，RT-qPCR分析证实，两个关键的Tuft细胞标志物POU2F3和GFI1B的表达水平在TCs中显著高于A型、AB型、B1型、B2型和B3型胸腺瘤（图2A）。
02 -TSQCCs普遍表达关键的Tuft细胞蛋白，POU2F3和GFI1B
124例福尔马林固定、石蜡包埋的TET（包括上述速冻病例中的部分（60例中的7例））的IHC显示，虽然阳性细胞的比例不一（图2C），但几乎所有的胸腺瘤和胸腺NENs都是阴性的，但约70%的TSQCC中都有POU2F3蛋白表达（图2B）。同样，GFI1B的表达在TSQCC和其他TET亚型之间有显著差异，但GFI1B阳性TSQCC的比例低于POU2F3阳性TSQCC。POU2F3和GFI1B的IHC也成功标记了胰腺中的正常Tuft细胞。
与TSQCC相反，来自其他器官的SQCCs和NENs通过IHC呈POU2F3阴性。值得关注的是，皮肤SQCCs也是POU2F3阴性，尽管POU2F3在正常角质细胞中表达（图2B）。
03 -Tuft细胞样和非Tuft细胞样的TSQCCs代表不同的子集
作者的TSQCC病例中共有30%，TCGA联盟和Petrini等的队列中也有类似数量的病例表现出非Tuft细胞样表型（图3A和补充图3B）。对所有胸腺瘤和TSQCC的全局基因表达谱进行分层聚类，发现所有的Tuft细胞样TC都聚成一个组，虽然非Tuft细胞样TC分散在胸腺瘤中（图3B）。在驱动基因突变和临床发现方面，两组的规模太小，无法得出有意义的结论（补充图5A和B）。相比之下，TC中最常见的染色体异常--16q的丢失，在所有的Tuft细胞样TC中观察到，但在TCGA和Petrini等的联合队列中的非Tuft细胞样TC中都没有（图3A和补充图5D）。
04 -TC的Tuft细胞样表型与KIT的表达密切相关
比较POU2F3和GFI1B的mRNA表达水平和TSQCCs的经典诊断标记基因、KIT和CD5，在作者和Petrini等的队列中，这两个Tuft生细胞标记物与KIT和CD5的水平有中等至强的相关性，但在TCGA数据集中的相关性较低。此外，在TCGA和Petrini等以及作者的队列中，Tuft细胞标志物和KIT表达的相关性始终很高，且强于Tuft细胞标志物和CD5之间的相关性（补充图5C、5E和6A）。
在蛋白质水平上，从免疫组化队列中随机选择的24个TSQCC中，有12个共表达POU2F3、KIT和CD5，所有POU2F3阳性的病例(N＝17)均表达KIT，尽管12个也是CD5阳性(补充图6B和C)。总之，KIT的表达与TCs的Tuft细胞样表型的相关性比CD5的表达更强。
05 -一种类似于Tuft细胞的特征和KIT的表达表征了NSCLC的子集
接下来对肺癌的TCGA数据进行分析，寻找簇细胞样mRNA信号。在TET结果的基础上，经验性地定义簇细胞样肿瘤为POU2F3和GFI1B的mRNA表达z得分均大于2（因此称为POU2F3和GFI1B共表达者）。
来自TCGA队列的484个肺SQCCs中，共有9个是POU2F3和GFI1B共表达者，这个子集不仅发现其他Tuft细胞标志物上调，而且还发现KIT上调（图4A和补充图7A）。对全局基因表达谱进行分层聚类发现，9个簇细胞样肺SQCC中的8个聚成一个组，表明它们形成了一个独特的亚型（图4A）。
利用基因本体富集分析，发现与细胞核相关的转录本，尤其是转录因子，在丛生细胞样肺SQCCs中显著富集（图4B），强调它们在转录本水平上与非丛生细胞样肺SQCCs不同。在基因水平上，RB1失活突变在tuft细胞样亚组中显著更常见，尽管TP53突变在两个亚组中同样分布（图4C和补充图7B）。
分析TCGA数据集提供的虚拟组织学切片，簇细胞样肺SQCCs的分化普遍比非簇细胞样病例差，9例中仅有3例表现为局灶性角化（补充图7D）。在临床上，女性和重度吸烟者在tuft细胞样肺SQCCs中的比例过高（图4D）。虽然在TCGA队列中发现簇细胞样肺SQCCs的阶段明显较低，但没有发现显著的生存差异（图4D和补充图7D）。
在510个TCGA肺腺癌中，有3个是Tuft细胞样肿瘤，与它们的SQCC对应物相似，它们表达KIT，聚集在一起(补充图7E)，显示RB1拼接突变或深度缺失以及TP53突变(补充图7F)，并且在组织学上分化较差(补充图7G)。事实上，在对合并的肺SQCCs和腺癌的TCGA数据集进行层次聚类分析时，两个队列的丛细胞样子集聚成一个组，表明它们的肿瘤生物学相似（图4E）。
分析了George等人提供的数据集，根据mRNA表达的绝对值确定了12个POU2F3和GFI1B共表达者和54个非簇细胞样病例（图5A）。前者显著共表达其他簇细胞制造者和KIT，12例中有8例在基因表达分析上聚成一个小群(图5A)。与之前对SCLC的研究一致，19例簇细胞样LCNECs不表达Rudin等提出的其他3个POU2F3阴性SCLC亚组的主转录因子，神经内分泌标志物CHGA和SYP的表达水平明显低于非簇细胞样LCNECs（图5B）。
与簇细胞样肺SQCC和腺癌相似，簇细胞样肺LCNEC常有TP53和RB1突变，且RB1突变频率明显高于非簇细胞样队列。此外，LCNEC整体典型的STK11热点突变，在所有簇细胞样LCNEC中都不存在（图5C）。尽管存在这些分子差异，但两组之间的临床特征并无不同（图5D）。
四、结论
本研究中，作者报告了tuft细胞相关基因，特别是POU2F3和GFI1B，在大多数TSQCCs中高表达。此外，肺鳞状细胞癌(SQCC)、腺癌和大细胞神经内分泌癌(LCNECs)等较小的子集也表达了类似tuft细胞的特征。总之，tuft细胞样表型确定了TSQCCs的一个新的亚组和不同的肺癌类型，具有不同的分子和病理特征。这种特征伴随着独特的临床、组织学和遗传学特征，表明它在各自的癌症类型中划分了生物学上相关的子集。
我现在搞清为什么医学期刊影响因子高。影响因子=被引用数/发表数(指两年内)，如某期刊上一年文章只被本期刊第二年引用，那么理论渣蠢改上最高影响因子=1，如果某学科只有一个期刊，则该学科影因最多为1。这样看医学类有档陪影因30的期刊，说明该学科同类期刊至少30个。所以影响因子高只能说明该学科期刊多并非人气旺如判。公平的指标=影响因子/本学科期刊总数。一本期刊ㄧ次刊登100篇文章不如分成10种期刊每种ㄧ次刊登10篇，影响因子立马增10倍。
An independent poor-prognosis subtype of breast cancer defined by a distinct tumor immune microenvironment
一种由独特的肿瘤免疫微环境定义的独立贫血亚型乳腺癌
发表期刊：Nat Commun
发表日期：2019 Dec 3
影响因子：12.121
DOI:10.1038/s41467-019-13329-5
一、研究背景
肿瘤微环境影响癌症的起始和进展。在乳腺癌中，临床病理特征，如年龄，等级，阶段和分子亚型与预后有关，并驱动治疗决策。5种临床相关的分子亚型：Luminal A、Luminal B、Her2富集型、基底样型和正常样型，其发病率、生存率、预后和肿瘤生物学特性各不相同。
除了癌细胞生物学因素外，炎中岁症微环境也影响着肿瘤的起始和进展。癌细胞周围的免疫微环境可以识别和抑制肿瘤生长或促进进展。在乳腺癌中，高免疫浸润已与更好的临床结果。此外，高免疫浸润已与新辅助和辅助化疗的反应增加相关。
二、材料与方法
1数据来源
1）基因表达：手术收集的MicMa队列（其中的子集用于分析， MicMa-nCounter（n = 96，FFPE），MicMa-Agilent（n=104，新鲜冷冻组织））
2）RNA-seq：OSLO2-EMIT0队列（GSE135298，原始数据在EGAS00001003631）
3）公开的数据：表达数据从GEO、European Genome-phenome Archive、ArrayExpress或TCGA获得；METABRIC队列
2分析流程
1）基因集富集分析
2）无监督聚类获得免疫簇：基于509个基因，使用R包pheatmap对患者的相关性矩阵进行层次聚类
3）Nanodissect：用于淋巴和髓细胞浸润的预测，淋巴细胞或骨髓细胞浸润的nanodissect分数反映了样本中各自基因的平均表达量
4）CIBERSORT（22种类型的浸润性免疫细胞的绝对比例）、ssGSEA（上皮间质转化、干细胞、增殖和细胞周期相关途径的基因集）
5）二项式逻辑回归预测免疫集群：R包glmnet （构建模型公式）
6）免疫浸润的病理评估
7）ROR评分：ROR-Score=0.05×Basal+0.12×Her2-enriched − 0.34×Luminal A+0.23×Luminal B；其中，基底、Her2富集、管腔A和管腔B是每个样本与R中使用genefu包获得的质心的相关性
8）统计学、生存分析、多变量Cox回归分析
三、结果展示
01 -乳腺癌的免疫簇并反映了逐渐的免疫浸润
测量了MicMa队列的95个肿瘤样本中760个基因的表达，该阵列旨在剖析实体肿瘤中的免疫浸润。这95个样本中的79个样本之前已经通过Agilent全基因组4×44K寡核阵列进行了剖析。首先使用Pearson和Spearman相关性比较了两个获得的表达，发现基因的表达值之间存在高度的正相关（补充图1A）。
为了根据免疫相关基因表达的相似性对患者进行分组，对相关矩阵进行了无监督的分层聚类（图1a和补充图1B）。从3到10个聚类的轮廓图分析表明，3个聚类最好地捕获了nCounter和Agilent数据集的分割（补充图1C，D）。比较了两个数据集MicMa-nCounter和MicMa-Agilent的聚类结果。在这两个数据集中，有79个样本是重叠的。随着用于测量基因表达的不同，以及基因列表和用于执行无监督聚类的样本的不完全重叠，仍然发现79个重叠样本的聚类分配显著相似。
为了确认集群与肿卖含睁瘤免疫微环境相关（图1b），使用算法Nanodissect为总淋巴细胞和骨髓细老桥胞浸润打分。Nanodissect评分首先在MicMa队列中使用有经验的病理学家分析的匹配苏木精和曙红切片的免疫浸润评估进行验证（图1c和补充图1E）。发现这三个簇与Nanodissect淋巴细胞（图1b）和骨髓细胞（补充图1F）评分显著相关。得出结论，簇A-C反映了逐渐的免疫浸润，因此被称为免疫簇。
使用其他9个队列的表达数据验证了这些簇与淋巴/髓细胞浸润之间的关联。有509个基因在所有研究的数据集中被发现，被用于无监督聚类（图1d和补充图2A，分别用于METABRIC和TCGA队列的聚类）。在每个队列中，所得到的三个聚类与淋巴和骨髓Nanodissect评分显著相关（图1e；补充图2B）。淋巴和髓细胞浸润从簇A（蓝色；低浸润；冷肿瘤）逐渐增加到簇B（浅蓝色；中等浸润）和簇C（粉红色；高浸润；热肿瘤）。
对于额外的一层验证，使用METABRIC队列中免疫浸润的病理评估，这与Nanodissect评分（图1f和补充图2C）和免疫簇显著相关。使用PanCancer免疫剖析阵列的基因进行无监督分层聚类，可以根据免疫浸润的渐进水平对乳腺癌肿瘤进行分组。
02 -免疫簇与预后相关
对于两个最大的队列METABRIC(n = 1904)和TCGA(n = 981)，发现簇B(具有中等水平的免疫浸润)与更差的预后相关(补充图3A，B)。当分别对ER阴性（补充图3C，D）和ER阳性（补充图3E，F）的病例进行分层时，也观察到簇B病例的这种更差的结果。为了完善观察结果，根据簇B（浅蓝色）与簇A和簇C（紫色）绘制了患者生存期图，并证实簇B患者的预后明显且显著恶化（图2）。用相关生存数据在另外四个队列中进一步验证了这一结果。结论是免疫簇与ER阴性和ER阳性乳腺癌的预后相关。
03 - 用二项式逻辑回归预测免疫簇
基于免疫聚类的临床相关性，旨在开发一种通用的方法，能够准确而敏感地预测患者的预后较差的分类，而不必依赖于无监督聚类。作者使用二项式逻辑回归，通过lasso进行惩罚，得到一组基因，这些基因可以敏感和特异地预测一个样本是否属于簇B，通过接收者操作特征曲线和曲线下面积（AUC）分析评估（图3a）。96.3%的样本被模型预测为簇A和簇C，而68.8%的样本分到了簇B（图3b）。
通过比较生存期对数秩检验p值，发现lasso分类普遍改善了免疫簇与生存期之间的显著关联。lasso模型在另外5个队列中得到了验证。图3c-e为STAM(n = 856)、MAINZ(n= 200)和UPSA(n = 289)，补充图5A、B为CAL(n = 118)和PNC(n= 92)。
由于二项式逻辑回归只预测了两个簇（簇B与簇A和簇C），进行了另一轮二项式逻辑回归，以高准确度区分簇A和簇C（补充图5C，D）。
04 -免疫簇，一个独立的预后因素
作者进一步研究了免疫簇与乳腺癌中著名的临床病理特征（大小、年龄、等级、阶段、淋巴结受累和分子亚型（PAM50））的关系。簇A（免疫浸润度低）富含ER阳性和Luminal病例，而簇C（免疫浸润度高）中ER阴性和Basal样病例比例较高，ER阴性和ER阳性样本以及PAM50亚型在预后不良的簇B中同样占有一定比例（图4a，b）。
使用多变量Cox回归分析测试了免疫簇的预后影响，同时考虑了其他预后因素。发现免疫簇是模型生存的重要因素，如每个队列Cox模型中与免疫群相关的显著p值所示。为了进一步检验免疫簇作为重要的预后生物标志物的优势，采用了逐步回溯选择的方法。对于所有队列，免疫簇被保留在最佳拟合的最小模型中，在11个队列中的9个队列中，免疫簇是一个显著的预后变量。
05 -具有复发风险（ROR）评分的新RNA-seq数据集的验证
EMIT0，这是OSLO2队列研究的一个子集，OSLO2-EMIT0由食品和药物管理局批准的Prosigna复发风险（ROR）分数评估，ROR评分在标准的临床病理特征之上增加了重要的预后信息。发现簇B组成的样本与簇A和C相比具有中间的ROR评分（图4c），表明与簇B相关的不良预后不可能由ROR评分中包含的信息来解释。当分别评估ER阴性（补充图7A）和ER阳性（补充图7B）病例时有同样结果。对于所有队列通过已有方法计算ROR评分，该方法与PAM50亚型有关，并证实簇B由中间ROR评分组成（图4d和补充图7C，D）。
多变量回归分析证实，免疫簇为ROR评分带来了额外的预后价值，这体现在用ROR评分和免疫簇建立生存模型时，免疫簇的p值显著。通过计算净重分类改善（NRI）和综合判别改善（IDI）指数，强调了免疫簇与ROR评分一起使用时，根据生存率对患者进行分类的额外价值，正如所有队列中NRI和IDI系数为正值所示。NRI和IDI的置信区间（CI）构建的Bootstrapping显示，对于几个队列，免疫簇与ROR评分相加时，显著改善了患者根据预后的分类。
06 - 免疫簇和对新辅助化疗的反应
进一步评估了免疫簇与新辅助化疗反应之间的关系，使用了来自8项研究（1377个样本）的基因表达数据，并使用lasso将每个样本分配给其所属的免疫簇。如图4e，发现簇C应答者百分比最高，其次是簇A，簇B应答者百分比最低。还计算了每个组中应答者的百分比：簇C平均有42%的应答者和58%的残余疾病患者，而簇B有18%/82%的应答者和13%/87%的残余疾病患者。由于pCR率作为ER状态的函数不同，还独立计算了ER阳性和ER阴性病例的应答者比例，发现无论ER状态如何，簇B的应答者比例最低（分别为补充图8A、B）。
对于每个对新辅助化疗有反应的队列，评估了pCR和非pCR病例在各免疫群中的分布。当考虑整个队列时，发现应答者在各免疫群组的分布有显著不同，簇B的应答者较少，簇C组的应答者居多；当按ER状态拆分时，虽然并非总是显著，但也观察到同样的趋势。这些结果表明，簇C中的患者有更高的概率成为应答者。研究结果还突出了簇B的低响应率，表明这类患者可能是新的新辅助治疗方案测试的候选人。
07 - 免疫簇的计算机剖析
为了评估集群中的逐渐免疫浸润是否可以解释与预后的关联，在Cox多变量回归分析中测试了免疫集群或总免疫浸润评分中哪一个对生存更有预测性。作者假设特定的免疫细胞类型混合物，而不是肿瘤微环境中的免疫细胞总数，可能是簇B预后差的原因。
使用CIBERSORT算法估计22种不同的免疫细胞类型的比例，对这种细胞类型特异性中位数浸润分数进行无监督聚类（图5a）。簇C病例中，富集了巨噬细胞M1、记忆激活T细胞和滤泡T辅助细胞（图5a），METABRIC和TCGA队列中CIBERSORT评分的分布也说明了这一点（图5b）。簇A如预期的那样，免疫细胞的水平非常低。在反应和预后较差的簇B中，发现巨噬细胞M2、静止肥大细胞和静止记忆T细胞的水平较高（图5a，图5b）。
使用广义线性模型，指定了区分簇B与簇A-C的免疫细胞类型（图5c）。还测试了哪些免疫细胞类型解释了簇A与簇B之间的差异和簇B与簇C之间的差异。
08 - 免疫簇的表型分析
通过差异基因表达分析确定了簇B中显著过度表达的基因，与簇A和簇C相比，簇B中有909个基因分别上调。这些基因与干细胞生物学和EMT相关，如使用MsigDB31的H和C2集合的基因集富集分析（GSEA）所示（图6a）。
为了进一步描述免疫簇与癌细胞表型之间的关系，使用了与EMT、干细胞、缺氧和增殖相关的基因集。使用GSVA方法计算了每个集群和队列的平均基因集富集分数，该分数反映了免疫集群中每个路径/基因集的活动。平均基因集分数的无监督聚类将免疫簇A和C分开，而簇B被分为两个亚组（图6b）。这些结果表明免疫簇与干细胞/EMT相关基因特征之间存在关联。
通过GSVA富集分数的无监督聚类，确定了乳腺癌中两个相互排斥的基因特征：（i）一个与增殖和胚胎干细胞样表型相关，（ii）另一个与EMT和乳腺干细胞表型相关。增殖表型在簇C中占主导地位（补充图11A），当计算每个代谢样品的基因集得分时也观察到了同样的情况（补充图11B）。在簇B中，EMT或增殖相关特征的平均基因集得分较高（补充图11C）。在代谢物组的样品水平上，我们观察到一个或另一个状态被激活的样品的类似模式（补充图11D）。簇A显示EMT和增殖状态得分较低（补充图11E，F）。
为了正式确定哪些基因集分数解释簇B，使用广义线性模型测试每个基因集的贡献程度。EMT标志对簇B有积极贡献，而增殖和细胞运动性与簇A和C相关（图6c）。还测试了当单独与簇A或簇C比较时，哪种基因集得分可以解释簇B。
09- 肿瘤表型与免疫浸润的相关性
由于免疫簇与（i）免疫细胞类型和（ii）基因集特征相关，评估了免疫浸润（CIBERSORT）和癌细胞特征（基因集分数）之间的关系。图6d显示增殖和EMT分数与不同类型的免疫细胞显著相关。高EMT分数与巨噬细胞M2、静息肥大细胞和静息记忆T细胞相关，而高增殖与更活跃的适应性肿瘤微环境相关。这些数据表明癌细胞表型和肿瘤微环境的组成之间存在连续性。
簇B以致瘤免疫浸润为主，EMT信号高，但约35%的簇B也表现为增殖表型。为了探索簇B中的这种异质性，以无监督的方式根据基因特征分数将样本分组为B1以EMT表型为主，B2以增殖为主（图6e）。
在METABRIC和TCGA中，具有增殖表型的B2病例的预后较差（图6f，g）。为了进一步评估基因集评分的异质性是否伴随着免疫环境的异质性，作者寻求B1和B2亚群之间特异性免疫细胞类型的差异。补充图14中的无监督聚类显示，两个子聚类B1和B2都具有促肿瘤/静息免疫微环境。总而言之，簇B中两种相互排斥的状态可能与预后有关；然而，簇B的一个统一因素是存在促肿瘤/静息免疫微环境。
四、结论
在本研究中，发现了与临床相关的免疫簇与渐进性免疫浸润。在15个乳腺癌队列中，跨越6101个乳腺癌样本，肿瘤免疫浸润中等水平的患者群预后较差，与已知的预后分子和临床病理学特征无关。通过对群组免疫成分的表征，发现亲肿瘤免疫浸润与不良预后组相关。进一步的表型分析显示乳腺癌中存在两种相互排斥的侵袭性肿瘤表型，一种与EMT有关，另一种与增殖有关。这两种表型都是在不活跃/促肿瘤免疫微环境上发现的不良预后群。
