目录取样生物学三次重复 生物重复是什么意思 生物重复和技术重复区别 生物学为什么要三次重复实验 实验重复三次怎样取结果
生物重复和技术重复分别是什么？在一个实验中应该如何安排生物重复和技术重复？
重复是实验设计的重要原则之一，实验重复无论对于实验结果的可重复性，还是对于最终实验结论的可靠性，都起着起决定性的作用。
实验重复还可以进一步细分为生物重复(biological replicates)和技术重复(technical replicates)，那么生物重复和技术重复分别是什么？在一个实验中应该如何安排生物重复和技术重复？
生物重复和技术重复分别是什么？
生物重复：指对同一个处理组中独立来源的重复样本分别进行独立分析，是整个实验的完全重复，如将具有同一基因型的多个细胞株进行独立地测定。由于遗传和环境等因素的影响会引起有机体的个体差异，因此需要采用生物重复的实验设计方法来消除该差异。目前都以3次生物学重复实验设计为主，要求严格的实验可以做5次重复。
技术重复：指对同一样本进行重复地检测分析，例如同一份细胞中抽提的蛋白质进行三次质谱检测，或者对同一RNA-seq样本测序3次。与生物学重复相比，技术重复的测量变异程度较小，从而可以减少实验中的分析变异，将对同一份样本产生高重复性的测量结果 。
简单来讲，生物重复是生物级别的重复，一般都是生物样本的重复。而技术重复，更多的是参数测定环节的重复，一般是对同一生物样本进行多次测定。
进一步分析，其实可以发现生物重复是衡量实验的总波动的（处理组间的差异不列入此处的波动，他们应该称为效应），它包括样本个体间差异和技术重复差异，而技术重复更多的是单纯的衡量参数测量时的波动，如实验操作娴熟程度、仪器稳定性等等。
在一个实验中应该如何安排生物重复和技术重复？
如此说来，对于一个实验来说，如果条件允许的话，最好把生物重复和技术重复做全了？
然而StatQuest推荐的策略是只需要生物重复即可，不需要技术重复。为什么？
只做生物重复
以小鼠的RNA-seq实验为例，先看一下生物偏差（biological variation）和技术偏差（technical variation ）。
下图代表小鼠的RNA-seq数据，虚线μ是总体小鼠的Read Counts，蓝色条代表5个样本小鼠的Read Counts。那那么样本小鼠的Read和总体μ是存在一定的差异的，我们将5个样本小鼠的Read取平均：
average = [(μ+5)+(μ-1)+(μ+4)+(μ+2)+(μ-5)] / 5 = μ + (5-1+4+2-5)/5
随着生物重复的增多，(5-1+4+2-5)/5会逐渐趋向于0，这个平均数也会趋近于总体搜咐均值μ。
刚才只考虑了生物生物偏差，没有考虑技术偏差，下图中添加悄灶了技术偏差，棕色条为生物偏差，绿色箭头为技术偏差，那么此时依然可以取5个样本小鼠的Read平均：
average = μ + (5-1+4+2-5)/5 + (-2+5+2-2-1)/5
随着生物重复的增多，生物偏差(5-1+4+2-5)/5 逐渐趋向于0，技术偏差也会逐渐趋向于0，这个平均数也会趋近于总体均值μ。
所以只做生物重复就可以很好的使用样本代表总体。
只做技术重复
继续进行实验，下图代表对1#小鼠测定了5次RNA-seq数据。那么同样方法取5个RNA-seq数据的平均：
average = μ + 5 + (-2+5+2-2-1)/5
随着技术重复数的增加，技术偏差(-2+5+2-2-1)/5会逐渐趋近于0，而这个平均数会逐渐趋近于μ + 5，永远也不会等于总体均值μ，因此做再多的技术重复，最终的RNA-seq数据也无法很好的代表总体。
同时做生物重复和技术重复
以下图为例，1#小鼠做了2个技术重复，2#小鼠做了3个技术重复，此时的生物偏差为5、5、-1、-1、-1，而技术偏差不变（技术偏差是参数测定时的偏差，不会因样本而异，而且因样本而已的偏差肯定是样本偏差），所以样本均值为：
average = μ + (5+5-1-1-1)/5 + (-2+5+2-2-1)/5
随着样本量启漏扮的增加，技术偏差(-2+5+2-2-1)/5会逐渐趋向于零。
但生物偏差(5+5-1-1-1)/5虽然也会收敛到0，但是此时所需要的样本量比‘只做生物重复’时大大增加，也就是说生物偏差的收敛速度变慢了。
这个生物偏差收敛变慢的速度有多慢呢？
假如多了3个技术重复，那么就需要3倍的样本量才能抵得上‘只做生物重复’时的收敛速度。说白了，就是多做的技术重复最多不过和‘只做生物重复’的效果持平而已。
做一下总结：
只做生物重复：最佳的实验设计，可以很好的代表总体；
只做技术重复，没有生物重复：不要使用这种实验设计，永远只会得到总体的有偏估计。
生物重复和技术重复：不推荐做，并不能很好的提高样本的代表性，要么获得一个有偏的估计，要么需要更多的样本。
你好，这是正常裤瞎现象，我们可以去两个样本的平均值。
生物重复：指对同一个处理组掘纯念中独立来源的重复样本分别进行独立分析，是整个实验的完全重复，如将具有同一基因型的多个细胞株进行独立地测定。由于遗传和环境等因素的影响会引起有机体的个体差异，因此需要采用生物重复的实验设计方法来消除判困该差异。目前都以3次生物学重复实验设计为主，要求严格的实验可以做5次重复。发现生物重复是衡量实验的总波动的（处理组间的差异不列入此处的波动，他们应该称为效应），它包括样本个体间差异和技术重复差异。
太长不看系列
技术重复：一个样本重复多次
生物学重复：同一批次每个生物重复一次（多次）
当生物学重复之间存在相关性，需要考虑有效样本数（effective sample size）
effective genome size和effective sample size不一样，不要混为一谈
废话超多系列
首先我们区分一下生物学重复和技术重复，有的人可能不屑一顾，和我的反应一样。但是别着急，答应我先区分下面两种情况属于什么重复，答对了再嘲讽我好么？
现在有一只小鼠A，我们对它的肌肉组织取样，连续三次检测其基因表达水平
现在有一只小鼠A，我们连续三次对它的肌肉组织取样，然后分别对该样品进行测序
文字不方便理解的话，可以看下面的图示：
事实上，这两种重复都是属于技术重复，因为它们都是针对的一只小鼠做的实验(一个生物)。但是这两种技术重复的侧重点有些许不同。
第一种技术重复，重点是RNA-seq检测方法的准确度。比如当你发现了一个新的检测基因表达量的方法，就需要用这种重复 来验证该方法的准确度
第二种技术重复，重点是检测这个 小鼠本身的基因表达水平， 而非检测方法。
那么，什么是生物学重复呢？比如我有一群小鼠，我挑选其中三只，做相同处理，然后分别取样检测基因表达水平：
这是因为，我们的每一次测量都来自于不同的小鼠（生物）。除此之外，我们还可以知道，生物学重复研究的重点从个体转移到了这类群体。
既然有了重复（有了不同的样本），我们接下来需要考虑的就是样本数的问题：
如果我们对检测基因表达水平的方法感兴趣，那我们的样本数与技术重复相关：
下面的情况，样本数为3（三个技术重复）：凯拍搜
假如我们对于蓝色小鼠这一族群感兴趣：
下面的情况，样本数为3：
下面的情况，样本数依然为3，这是因为技术重复不影响我们关注的重点（技术重复关注的是个体或者是方法的准确度）
假如我们对小鼠的某一族群感兴趣，我们对三种颜色的小鼠都检测一下基因表达：
但是，如果蓝色小鼠有一个双胞胎弟弟，那么此时的样本数是多少呢？是3还是4呢？
事实上，样本数介于3和4之间。这个时候，样本数不再是简单的加和，而是要考虑有效样本数（effective sample size）。计算公式如下：
此时我们需要关注这两只蓝色小鼠的相关性，若相关系数为0.7，则这俩双胞胎所代表的样本数为2/(1+(2-1)*0.7)=2/(1+0.7)=1.18
若相关系数为0.1，则这俩双胞胎所代表的样本数为2/(1+(2-1)*0.1)=2/(1+0.1)=1.82
由此可知，两个双胞胎小鼠的相关性越低，所代表的样本数越大。相关性越大，则所代表的样本数越小。甚至若二者完全相同，我们可以把盯历他们看作是一个（把他们看作是技术重复，不影响样本数）
写在后面的话
需要注意的是，很多人使用过deeptools，里面涉及到一个effectiv genome size的定义。该定义贺兆与effective sample size完全不同，千万不要混淆。
effective genome size相当于是去除了基因组中为N的那些碱基之后的长度。
"生物学重复"指的是经过相同方式处理的相同样品。如图所示，对照组A、B、C三只小鼠 (control A, B and C) 互为生物学重复。实验组A、B、C三只小鼠(Treated A)同样互为生物学重复。
"生物学重复"的大银概念容易与"技术重复"相混淆。一衫敬般来说，技术重复指的是同一样品多次测量。如图所示，任一小鼠在板A、B、C中被重复测量了三次或仿慎，即技术重复了三次。
如果你对这个答案有什么疑问，请追问，
另外如果你觉得我的回答对你有所帮助，请千万别忘记采纳哟！
在RNA-Seq等测序设计中，生物学重复和技术重复，是非常需要注意的问题。
那么问题就来了，生物学重复和技术重复，到底是什么？它们是如何影响我们的实验设计的。
生物学重复 （biological replicate）：可以理解为我们对一个群体进行研究，但是我们不会对整个群体进行检测（考虑到成本和工作量的问题，我们肯定也不会采取这种地毯式的方法），只是抽取群体中的一部分进行检测，用样本来代表总体。
这边样本个数，实际上就是生物学重复数。
技术重复 （technical replicate）：对一个样本的数值进行多次测定。
下表给出常见实验对应重复类型：
Replication这篇文章以测定小鼠肝脏细胞中的某一个gene的表达量为例，展示了什么是生物学重复和技术重复以及如何权衡这两者之间的关系。
分别给出3种类型的重复，分姿搏别为：毕册旁
（1）animal水平的重复
（2）cell水平的重复
（3）技术重复
由上图可以得到，3种不同种类的重复，所计算出来的表达量方差是不一样的，但gene表达量的总方差，可以有下列公式计算得到：
接下来，将总体的重复次数限定，即在满足的前提条件下，对Var(X)进行计算。
1、当和均为1，为48的情况下，计算出来的Var(X)如下图标记：
这种情况下，只反映了由于cell样品重复和技术重复所引起的基因表达量误差。当n_{A}=1（动物样品数为1），即无法计算由于animal样品数变化，所带来的基因表达量误差。
因此在上述情况下，就被低估了。
2、当和均为1，为48的情况下
计算得到的基因表达量误差完全是由于技术重复所引起的。因此，如果我们将这种情况下的误差，认定为由生物重复所引起的，就造成了假阳性。
同样地，每一种重复对于真实基因表达量的方差贡献也不是相同的。
因为cell重复和测定技术重复，并是一个独立变量。技术重复本质上是对同一份样品进行测定，数据在这种情况下的变异，完全是由于人为或机器造成的，而cell重复在本质上可以认为与animal样品之间存在相关性，因此也不是独立的。
3、从的角度，来选择replicate
【标注】越小，代表对估计越准确
可以看到的是，当增大animal重复数时，趋于一个稳定值，该样本对总体的估计达到了一个较为准确的水平，同时的值也接近于0。
4、从统计检验的角度，来选择replicate
使用two-sample t检验，来判断cell样品的gene表达量方差、动物样品表达量均值之间是否存在显著差异。
下图很明显的一个结果就是，随着的手橡增加，统计检验的效能得到提升，假阳性也在降低（同时也得权衡和）
对于一组数据来说， 研究对象的生物重复比技术重复更能够反映总体 ，因此在进行实验设计时，最好将实验/测序资源倾向这边，而不是技术重复（除非对技术重复所诱发的影响感兴趣）
[1]刘小乐老师-哈佛计算生物学与生物信息学
[2] Blainey P, Krzywinski M, Altman N. Points of significance: replication[J]. Nature methods, 2014, 11(9): 879.
