目录illumina高通量测序原理 菌群高通量测序 土壤微生物高通量测序 高通量单细胞测序技术 微生物测序是什么意思
病原微生物宏基因组高通量测序呈阳团侍性意味着实验中检测到的样本中包含有病原微生物的遗尘侍传物质，也就是说这个样塌兄吵本是由这些病原微生物引起的。宏基因组高通量测序技术可以快速、准确地检测出样品中存在的所有微生物，从而帮助我们准确诊断感染性疾病。
在陆地生态中，在土壤中生活有数量庞大的微生物种群，包括原核微生物如细菌、蓝细菌、放线菌及超显微结构微生物, 以及真核生物如真菌、藻类( 蓝藻除外) 、地衣等。它们与植物和动物有着明确的分工，主要扮演“分解者”的角色，几乎参与土壤中一切生物和生物化学反应，担负着地球C、N、P、S 等物质循环的“调节器”[1 ]、土壤养分植物有效性的“转化器”和污染环境的“净化器”等多方面生态功能[2 ]。土壤微生物是气候和土壤环境条件变化的敏感指标，土壤微生物群落结构和多样性及其变化在一定程度上反映了土壤的质量。土壤微生物多样性一般包括微生物分类群的多样性、遗传(基因) 多样性、生态特征多样性和功能多样性[3 ]。由于土壤微生物的复杂性、土壤本身的多变性和研究方法不完善等原因的限制, 以往人们对土壤微生物多样性的研究与动、植物相比远远落后。随着多聚酶链反应(PCR)、核酸测序等现代生物学分子生物学技术的迅速发展, 人们对土壤微生物多样性有了更多的了解；高通量测序技术的发展则为研究土壤宏基因组提供了大量数据，为直接探究土壤中的微生物群落结构提供了客观而全面的信息。
一、对土壤微生物进行研究的方法
1、微生物平板培养法
传统的土壤生态中微生物群祥贺猜落多样性及结构分析大多是将微生物进行分离培养，然后通过一般的生物化学性状，或者特定的表现型来分析，局限于从固体培养基上分离微生物。
这种方法只限于极少量（0.1%-1%）可以培养的微生物类群，无法对绝大多数微生物的分类拍戚地位和发育关系的深入研究。
2、分子生物学技术结合测序的方法
在过去的20多年里，分子生物学技术，尤其16SrDNA技术已经广泛应用于鉴定未知菌的研究中。20世纪80年代以来, 逐步建立起了以分子发育分析为基础的现代微生物分子生态学的研究方法, 如PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、荧光原位杂交技术(FISH)、基因芯片(Microarry) 、磷脂脂肪酸图谱分析( Phospholipid fatty acid, PLFA) 、稳定同位素探针( Stable Isotope Probing, SIP) 、PCR-DGGE/TGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE/Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE) 等, 使得研究者能够在分子水平上对土壤微生物多样性进行研究。
其中运用比较广泛并被普遍认可的是PCR-DGGE/TGGE法。DGGE/TGGE 的局限性在于，检测的DNA片段长度范围以200bp ～900bp为佳，超出此范围的片段难以检测[4]，PCR 扩增所需G/C 碱基对含量至少达40 % ，通常只能检测到环境中优势菌群的存在，只有占整个群落细菌数量约1％或以上的类群能够通过DGGE检测到[5]。TGGE 仪器所允许的温度范围为15 ℃～80 ℃，较大片段DNA 的Tm 值因为接近80 ℃而使检测难度提高；若电泳条件不适宜，不能完全保证将有序列差异的DNA片段分开，从而出现序列不同的DNA 迁移在同一位置的现象。
3、高通量测序方法
近年来，16S rRNA/DNA为基础的分子生物学技术已成为普遍接受的方法[6,7 ]。研究表明，400～600碱基的序列，足以对环境中微生物的多样性和种群分类进行初步的估计[8]，因此454高通量测序的方法因其读长（400~500bp）长和准确性高的特点大量用于微生物多样性的研究。
有了微生物16S rDNA序列，不论是全长还是部分，都可以提交到GenBank采用BLAST程序与已知序列进行相似性分析。Gen Bank将按照与测得序列的相似性高低列出已知序列名单、相似性程度以及这些序列相对应的微生物种类，但更为精确的微生物分类还取决于发育分析(phylogenetic analysis)。
高通量测序的优越性体现在：测序序列长，可以覆盖16S /18S rDNA、ITS等高变区域； 测序通量高，可以检测到环境样品中的痕量微生物；实验操作简单、结果稳定，可重复性强；无需进行复杂的文库构建，微生物DNA扩增产物可以直接进行测序，实验谨型周期短；测序数据便于进行生物信息分析。
该方法得到顶级期刊的认可（Nature等），已成为土壤微生物多样性检测的重要手段。上海美吉生物公司已有若干成功案例，为客户提供的土壤样本进行高通量测序并进行生物信息学分析。高通量测序因其数据量大，操作过程简单，尽可能避免了繁琐的实验操作过程所造成的样本损失，能够相对客观的反应出土壤样本的真实情况。
二、高通量测序在土壤微生物研究中的应用
1、 研究土壤微生物的物种多样性
微生物物种多样性主要从对微生物类群即细菌、真菌和放线菌这三大类群的数量及其比例组成来描述微生物多样性，或者按照微生物在生态中的作用将其划分成不同的功能群(function group)，通过某一功能群中物种的分类及其数量来研究土壤微生物多样性，如对土壤中的产甲烷细菌、固氮菌、根瘤菌等的多样性进行研究。以下是几篇具有代表性的文章。
Roesch等[9]采用454测序法对西半球的一个大的横断面的4类土壤进行检测和统计学评价。结果表明，这4种土壤中，最丰富的微生物类群拟杆菌纲、β-变形菌纲和α-变形菌纲。与农业土壤相比，森林土壤的微生物多样性更为丰富，然而检测结果表明森林土壤中的古生菌多样性较少，仅为该位点所有序列的0.009%，而农业土壤的比例则为4% -12%。
土壤中细菌的多样性差距非常大，因土壤结构的不同土壤中的细菌群体也呈现出多样化。Triplett等[10]基于焦磷酸测序法来对16S rRNA的V2-V3区域进行测序，估测9个草地土壤中的菌群的整体和垂直特性。对所有752,838条数据序列进行聚类分析，探索菌群在丰度、多样性和组成成分等方面的特异性。作者发现在不同的土壤层中，细菌发生的种群或者亚群的不同分配是与土壤的性质有关的，包括有机碳含量、总含氮水平或者微生物生物量。
2、研究土壤微生物功能多样性
土壤微生物功能多样性指包括微生物活性、底物代谢能力及与N、P、S 等营养元素在土壤中转化相关的功能等, 通过分析测定土壤中的一些转化过程, 如有机碳、硝化作用以及土壤中酶的活性等来了解土壤微生物功能。
氨氧化反应是硝化作用的第一步，也是全球氮循环中由微生物活动形成硝化盐的重要进程。Leininger[11]检测了3个气候区域12块原始和农业用地的土壤里编码氨单加氧酶(amoA)的一个亚基的基因丰度。采用反向转录定量PCR研究及无需克隆的焦磷酸测序技术对互补DNA测序，证实古细菌的氨氧化活性要远高于细菌，证实Crenarchaeota可能是土壤生态中最富有氨氧化活性的微生物。
Urich等[12]采用基于RNA的环境转录组学方法同时获得土壤微生物种群结构和功能信息。结果认为，通过该方法可以同时研究微生物生种群结构与功能从而避免其他方法所造成的偏差。群落基因组学分析可以通过研究微生物基因组序列与某些表达特征之间的关系，获得一些微生物功能方面的信息。但同时也需要运用其他方法将特定功能与具有这种特定功能的微生物群落结构对应起来。对rRNA表达基因和与环境因素相关的主要酶类的基因进行定量化和比较分析，将能了解微生物结构与特定功能之间的关系，如硝化、反硝化和污染物降解。
反硝化作用是参与到氮流失和温室气体排放等氮循环过程的重要流程之一。通过宏基因组测序的方法，结合分子检测和焦磷酸测序，Ryan等分离鉴定了操纵编码反硝化过程的酶类。通过筛选77,000个土壤宏基因组文库中得到的克隆，最终分离并鉴定了9个参与反硝化作用的酶簇[13]。
3、 研究环境的突然变化对土壤微生物菌群的影响
环境的突然改变会导致微生物群落的结构和功能发生变化。Zachary等[14]以重水稳定同位素探测技术（H218O-SIP）鉴定与土壤增湿相关的细菌。通过液相色谱/质谱（LC-MS），作者确定H218O中的氧原子结合到了所有的DNA结构成分中。尽管这种结合不是均匀的，还是可以明显的将标记了18O和未标记的DNA区分开来。作者发现DNA和细胞外的H2O中的氧原子在体外没有发生交换，表明掺入DNA的18O是相对稳定的，并且掺入到细菌DNA中的18O的比例较高（48-72h）。土壤增湿后，对土壤中16S rRNA进行高通量测序，发现Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相对比例升高，而Chloroflexi和Deltaproteobacteria的比例则降低。作者通过控制土壤湿度的动态变化，对微生物菌群的结构发生变化进行研究和生态类群的划分。
如芹悉高何读懂微生物测序数据质量宏基因组是指特定环境中全部生物（微生物）遗传物质的总和。宏基因组测序是利用高通量测序技术对环境陆迟样品中全部微生物的基因组进行测定，以获得单个样品的饱和数据量，可进行微生物群体的基因组成及功能注释，微生物群体的物种分类，多样性分析，群落结构分析，样品间的物种或基因差异以及物种间的代谢网络研究，探索微生物与环境及宿主之间的关系，发掘和研究新的具有特定功能的基因等。与传统方法相比，基于高通量测序的宏基因组研究无需构建克隆文库，这避免了文库构建过程中利用宿主菌对样品进嫌尺行克隆而引起的偏差，简化了实验操作，提高了测序效率。此外，宏基因组测序研究摆脱了微生物分离纯培养的限制，扩展了微生物资源的利用空间，为环境微生物群落的研究提供了有效。通过宏基因组深度测序可以揭示或估计环境中真实的物种多样性和遗传多样性，挖掘具有应用价值的基因资源，应用于开发新的微生物活性物质，为研究和开发新的微生物活性物质提供有力支持。
高通量测序不需要把三个平行都放在一起分析。根据相关信息显示个PCR混合常用于高通量测序过程中，用于睁茄消除单次PCR带来的误差。近年来DNA聚合酶的活性和稳定性有了很大的提高，是否需要做那么多平行(时间、金钱、人力成本)开始受到人们的关注。实验实施于3个独立的实验室，测试不同扮早滑环境（粪便、土壤、海洋沉积物、海水、皮肤、口腔、床垫灰尘样本）得到的373个样本，比较单厅腊次PCR和3次PCR混合产物经16S测序后的差异。结果表明单次PCR得到的reads显著高于三次PCR混合，且A.单次PCR的sequencingdropoutrate更低。B.alpha多样性(shannon)无显著差异，C.UnweightedUniFrac表征的beta多样性表明样本按照不同环境，而不是PCR平行数分开。D.WeightedUniFrac表明样本之间的差异不同环境>生物学重复>技术重复。
在人体肠道中生活着数以万亿的共生菌群，它们的种类繁多，可达上千种，数量也很惊人，是人体细胞总量的10倍以上，迄今为止，仍有80%以上的微生物不为人知。这些肠道微生物和人体存在着互利共生的关系，对于维持人类的健康发挥着重要的作用。它们在肠道中保持着一种动态的平衡，能够合成维生素、帮助人体从食物中吸收营养、维持肠道免疫功能、抵挡有害微生物的侵害，但是当这种平衡因某些因素被打破致使肠道菌群发生紊乱时，人体就可能患上诸如肥胖症、糖尿病、肠炎甚至癌症等疾病。为了加深对人类疾病发生原因、药物作用机理的理解，继人类基衫如埋因组计划之后，科学家们又启动了人类元基因组计划，这使肠道菌群的研究迎来了一个新的浪潮。
在以往的肠道微生物群落多样性研究中，人们主要采用DGGE等分子生物学方法及生物芯片对肠道菌群进行研究，但是这些或蚂方法都存在一定的缺陷。如DGGE只能检测到环境样品中十几种优势菌，但是对痕量微生物却束手无策；电泳条带中包含不只一种16S rDNA序列，要获橡猜悉具体的菌种信息，还需进行克隆、测序，实验操作繁琐；此外，采用这种方法不能反映微生物的丰度情况。而生物芯片通过固定在芯片上的探针来获得微生物多样性的信息，“只能验证已知，却无法探索未知”，通过信号强弱判断微生物的丰度也不是非常的准确。新一代高通量测序技术自2005年问世以来，以其数字化信号、高数据通量、高测序深度、高准确率等特点，已被广泛的应用于肠道菌群的研究中，发表的论文达60多篇，其中不乏发表于Nature、PNAS、Genome Res、Gut、Gastroenterology等国际顶尖杂志上的文章。Roche 454测序由于读长较长，达300～500bp，能跨越16S rDNA序列一个或几个可变区，是微生物多样性研究的最佳，使用该发表的关于肠道菌群的论文达50多篇。美吉生物拥有Roche 454测序，在肠道微生物群落多样性研究方面积累了大量的成功案例。
美吉生物研究人员通过大量相关文献的阅读，发现高通量测序技术在肠道菌群多样性研究中的应用主要聚焦于以下几个方面：① 饮食、能量摄取、肥胖与肠道菌群之间的关系；② 肠道菌群与疾病发生之间的关联；③ 抗生素治疗对肠道菌群的影响；④ 不同个体肠道微生物群落结构及其受其他外界因素（压力、致病菌感染、手术）的影响等。
